燕麦(Avena sativaL.)是全球重要的粮饲兼用作物之一[1],我国每年对燕麦草等优质饲草的需求为1.2亿吨[2]。燕麦易于栽培，具有耐贫瘠、耐盐碱、抗旱耐寒、适应性强、营养价值高的特点，在中国北部、西北部和西南部广泛种植[3][4]。青贮饲料相较于干草饲料具有营养流失少、易于长期保存、适口性好、消化率较高等特点[5][6]。青贮饲料营养价值参数高效和准确地测定是控制反刍动物精准营养的关键[7],传统的青贮饲料品质检测会破坏样品，检测费时、费用昂贵，需要配置良好的设备和经过培训的操作人员，不能即时获知指标数据，对生产指导显现出严重的滞后性[8][9]。因此，急需寻求高效、简便的现代分析技术来适应生产快速检测要求。

现代近红外光谱(Near infrared spectroscopy, NIRS) 分析技术起源于上世纪50年代末期，目前已广泛地用于农业、食品、石化和制药等领域[10]。Norris最早应用近红外光谱测定饲料中水分和蛋白质含量[11],目前该技术已广泛应用于饲料领域现场快速检测、精准配料、批量检测及在线分析等[12]。近红外光谱能获取绝大部分有机物组成性质以及分子结构的有效信息，在近红外光谱范围内，测量的主要是含氢基团XH (X=C,N,O,S等) 振动的倍频及合频吸收[13],青贮饲料的主要成分在近红外区域都有该成分特有的吸收特性。在测定样品时无前处理、无污染，可以快速、准确地评估饲料的化学成分和相关的饲用价值属性[14]。

青贮饲料与反刍动物生长性能及牧场经济效益关系密切，其原料来源广泛，品质会受牧草品种、收获时的成熟阶段、气候条件、收获技术、添加剂的类型和青贮的方法等影响[15][16]。因此，探索能够满足实际生产需要精准度，且能适用于不同地域、不同品质、饲草品种等未知场景的饲草青贮品质近红外光谱预测模型，具有重要的意义。本研究选取燕麦饲草青贮样品，扫描干燥样品和新鲜样品近红外光谱，讨论燕麦饲草青贮样品状态对建模的影响，建立燕麦饲草青贮品质评估近红外模型，旨在为饲草生产提供一种高效分析品质的方法。

1 材料与方法

1.1 样品采集与制备

2020—2021年于四川成都、内蒙古呼和浩特、河北张家口、甘肃张掖、江苏扬州、贵州遵义、山东济南地区(表1)采集乳熟期的全株燕麦饲草，通过不同晾晒时间、发酵温度、添加剂种类和青贮时间的处理，制作青贮样本。对照组为刈割后直接青贮并常温储藏。不同的晾晒处理为分别为自然晾晒2 h, 4 h, 6 h。不同的温度处理设4个水平，为5℃,15℃,25℃,30℃,置于恒温培养箱保存。添加剂处理设3个水平，分别为植物乳杆菌、纤维素酶、植物乳杆菌+纤维素酶。全株燕麦刈割后立即用铡刀将材料切割至2～3 cm, 充分混匀，每300 g原料装入聚乙烯袋青贮袋(28 cm×35 cm),真空密封，青贮30天、60天和90天，3个重复，共273个样品。

1.2 化学参考值测定

开袋后，均匀混合青贮样品。通过四分法取青贮样品20 g, 加入180 mL无菌盐水，放置于4℃条件下浸提24 h。用滤纸过滤，得到浸提液，取部分浸提液于4℃,10 000 r·min-1,离心5 min。上清液通过0.22 μm微孔滤膜过滤用于有机酸(乳酸，乙酸，丁酸)和氨态氮含量分析。氨态氮含量采用苯酚-次氯酸比色法测定[17],有机酸含量通过高效液相色谱测定[18](色谱柱：KC-811column, Shimadzu, 日本。检测器：SPD-M10AVP。流动相：3 mmol·L-1高氯酸，流速1 mL·min-1。柱温50℃,检测波长210 nm, 进样量5 μL)。

取燕麦青贮样品约250 g, 放置于65℃烘箱中烘干至恒重后，测定干物质含量，然后使用粉碎机粉碎并过1 mm筛，粉碎样品用来测定可溶性碳水化合物、粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。采用蒽酮硫酸法测定可溶性碳水化合物含量[19];粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定[20];中性和酸性洗涤纤维含量采用范氏法进行测定[20]。

1.3 光谱采集

光谱的采集与化学参考值的测定同时进行，新鲜样品的光谱在青贮开袋时进行采集，250 g样品经烘干粉碎过筛后，扫描获得干燥样品光谱。实验仪器为意大利Grainit.S.L公司生产的GraiNit AuroraNir (DA)型便携式近红外光谱仪：光谱范围为950～1 650 nm, 每2 s扫描2次，每个样品重复装样扫描4次，自动记录平均光谱为试验光谱。环境条件为：温度10～30℃,湿度30～70%,扫描样品均在仪器配套的样品采集盒内进行。

1.4 近红外光谱校准模型的开发和验证

近红外光谱分析过程利用UCAL软件(美国Unity科学)进行光谱预处理及回归分析等处理。光谱预处理选取标准正态变量变换+去趋势，多元色散校正+去趋势，一阶导数+去趋势，标准正态变量变换+多元色散校正+去趋势+一阶导数四种方式进行数学处理，以交叉验证标准差(Standard error of cross-validation, SECV)为考察指标，比较分析四种方法的定量分析结果，确定最小SECV所对应的方法为最优光谱预处理方法。在进行PLS回归之前，对所有光谱数据集执行主成分分析(Principal component analysis, PCA),以识别和去除光谱异常值，异常样品的判断以标准马氏距离(GD值)为考察指标，当GD值>3时判定该样品异常并予以剔除，然后将样品按照4∶1比例随机分为校正集和验证集，校正集用于开发回归模型，验证集用于评估已建立模型的性能。

回归模型使用偏最小二乘法(PLS)建立，建模过程中为了选择最佳方程，模型评估的统计量为：校正决定系数(Correction of calibration,R2)、交叉验证决定系数(Correction of cross validation,R${}_{\text{c}\text{v}}^2$)和校正标准差(Standard error of calibration, SEC)、交叉验证标准差(SECV),R2和R${}_{\text{c}\text{v}}^2$越接近1,SEC和SECV越小，说明模型效果越好。最优方程确定后，通过外部验证决定系数(Correction of validation,R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$)和相对分析误差(Ratio of performance to deviation, RPD)对校正模型的实际效用做进一步评估，R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$越接近1,说明模型的预测精准度越高。当R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$>0.80时，校正模型可用于实际检测；当0.66≤R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$<0.80时，校正模型可达到粗估的效果；当R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$<0.66时，该模型不能用于实际检测[21][22]。当RPD≥2.5时，校正模型可用于实际检测；当2.0≤RPD<2.5时，说明校正模型预测结果可达到粗估的效果，但预测精度需进一步提高；当RPD<2.0时，校正模型不能用于近红外定量分析[21][22]。

2 结果与分析

2.1 光谱特征

由图1燕麦饲草青贮新鲜和干燥样品的近红外光谱可知，燕麦饲草青贮新鲜、干燥样品近红外光谱具有相同的吸光度带，且表现出相似趋势，在950～1 650 nm范围内具有较强吸收峰，但吸收程度不同，燕麦饲草青贮新鲜样品比干燥样品光谱波动变化更大，两者都在1 150～1 200 nm, 1 400～1 500 nm处有较强的吸收峰，1 350～1 400 nm处有较弱的吸收峰；新鲜样品光谱图中 960～1 000 nm有较强的吸收峰，而干燥样品光谱图中没有出现吸收峰。

2.2 化学成分参考值的描述性统计

表2显示了用于近红外建模的燕麦饲草青贮校正集和验证集含水量、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗蛋白、可溶性碳水化合物、粗脂肪、氨态氮、乳酸、乙酸和丁酸含量平均值、最大值、最小值、标准差及变异系数的描述性统计结果。校正集和验证集样品的化学成分含量描述性统计量基本一致，验证集的范围在校正集记录的范围内，且所有成分浓度范围较广，为构建预测模型提供了足够的范围。

2.3 燕麦饲草青贮校正模型

燕麦青贮新鲜样品的校正模型和内部交叉验证的结果如表3所示，含水量的校正结果最好，其校正决定系数R2达0.98,校正标准差SEC为1.06;酸性洗涤纤维的校正结果次之，R2为0.92,SEC为1.48;中性洗涤纤维、可溶性碳水化合物、乳酸的R2在0.81～0.90之间，粗蛋白、粗脂肪、氨态氮、乙酸、丁酸的校正效果较差，R2分别为0.78,0.69,0.58,0.72,0.76。经过内部交叉验证，仅有含水量的交叉验证决定系数R${}_{\text{c}\text{v}}^2$>0.9,交叉验证标准差SECV为1.22;酸性洗涤纤维和可溶性碳水化合物的R${}_{\text{c}\text{v}}^2$分别是0.86和0.80,SECV分别是1.88和0.48;中性洗涤纤维和乳酸的R${}_{\text{c}\text{v}}^2$为0.72和0.70,模型性能较差，粗蛋白、粗脂肪、氨态氮、乙酸、丁酸的R${}_{\text{c}\text{v}}^2$均小于0.70,模型性能不理想。

表4显示了青贮干燥样品的校正模型，仅丁酸校正模型的决定系数R2<0.80,未达到理想要求。其中含水量、酸性洗涤纤维、粗蛋白、乙酸的R2>0.9,分别是0.95,0.95,0.94,0.93,SEC为1.69,1.19,0.39,0.36,校正效果好；中性洗涤纤维、可溶性碳水化合物、粗脂肪、氨态氮、乳酸的校正效果次之，R2为0.89,0.86,0.87,0.89,0.85;SEC分别是2.13,0.53,0.37,4.25,1.11。模型的内部交叉验证结果显示，含水量、酸性洗涤纤维的交叉验证系数R${}_{\text{c}\text{v}}^2$大于0.9,分别是0.94和0.93,SECV为1.18和1.28,模型的性能较好；中性洗涤纤维、粗蛋白、可溶性碳水化合物、粗脂肪、氨态氮、乙酸的R${}_{\text{c}\text{v}}^2$在0.80～0.90之间，分别是0.87,0.86,0.82,0.80,0.84,0.85;乳酸和丁酸的R${}_{\text{c}\text{v}}^2$值分别是0.74和0.70,模型性能较差。

2.4 模型预测性能评价

燕麦饲草青贮校正模型建立后，用外部验证对所建模型预测效果进行评价。燕麦饲草青贮新鲜样品化学成分校正模型外部验证结果如表5所示，预测值和实测值的回归关系如图2所示。含水量和酸性洗涤纤维模型的外部验证相对分析误差RPD>2.5,其外部验证决定系数R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$>0.80,分别为0.94,0.88,模型的预测精度高，能用于实际定量分析；而其余化学成分模型的R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$<0.80,RPD小于2.5,模型预测效果差，不能用于实际预测，其预测精度有待进一步提升。

燕麦饲草青贮干燥样品化学成分校正模型外部验证结果如表6所示，预测值和实测值的回归关系如图3所示。其中含水量的模型预测结果最佳，外部验证决定系数R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$为0.90,RPD为3.17,模型能够准确的进行定量分析；酸性洗涤纤维模型的R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$为0.90,RPD值为3.09,模型表现出了优秀的预测效果；粗蛋白模型的预测准确度略低于含水量和酸性洗涤纤维，R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$和RPD分别是0.88和3.00,模型能够应用于实际检测；可溶性糖碳水化合物、粗脂肪、丁酸的R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$分别为0.85,0.85,0.83,RPD值接近2.5,分别为2.44,2.43,2.35,中性洗涤纤维的PRD为2.04,R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$为0.76,乳酸的RPD值为2.02,R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$为0.75,表明定量模型能的进行粗略的实时分析，预测精度有待提升；氨态氮和乳酸的RPD值小于2.0,预测结果表现较差，模型不能用于实际分析，预测精度需进一步提高。

3 讨论

自20世纪90年代起，随着近红外光谱仪器的更新迭代和化学计量学理论和方法的不断完善，NIRS分析技术成为饲料生产者、植物育种者、养殖户和饲料公司分析常规样品最常用的技术手段[23]。目前，近红外光谱分析技术已广泛用于青贮饲料品质的测定[24][25][26],对青贮饲料的常规营养成分和发酵产物都有较好的预测效果。在燕麦干草上，国内学者已建立了近红外光谱模型，能准确的预测其营养成分[27][28]。燕麦青贮在高寒地区畜牧业稳定发展中发挥重要作用[29][30],国内应用近红外技术测定燕麦青贮饲料品质的报道少有。本研究采集制作254份燕麦青贮样本，建立了营养成分和发酵品质的定量分析模型。除了含水量的预测结果以外，干燥样品模型的预测精度优于新鲜样品，外部验证决定系数R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$和RPD值均大于干燥样品，这与Dias等人的研究结果相似[31]。新鲜样品含水量和酸性洗涤纤维的模型能够用于实时定量检测，其余指标均无法应用于实时检测分析，推测可能有两种原因：一是新鲜样品中存在较多水分，有研究表明，由于样品水分含量的变化，NIRS预测牧草体外发酵参数的准确性可能会改变，去除残留水分会降低校正标准差与交叉验证标准差[32],也有学者发现去除牧草样品中的残留水分提高了矿物质测定的校准精度[33];二是青贮新鲜样品的粒径较大、不均一，粒径变化影响了光谱分布和模型的校正结果[34][35][36]。新鲜饲草的光谱分析精度在很大程度上受到水分的限制，样品的粒径过大引起的散射也会导致模型的精度降低。有学者提出，二阶导数可能减少了颗粒大小异质性和含水量所造成的光谱噪声，从而能够分辨出与待测含量更相关的光谱信息[37]。因此，可以通过研磨粉碎等方法提高样品均一度，也可以尝试利用二阶导数预处理结合多元散射校正等从而提高模型精确度。

干燥样品的含水量、酸性洗涤纤维和粗蛋白的模型能够用于实时检测分析，R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$为0.90,0.90,0.88,RPD为3.6,3.2,2.9,中性洗涤纤维、可溶性碳水化合物、粗脂肪的值能达到粗估的检测效果，R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$分别为0.76,0.85,0.85,RPD值为4.56,2.44,2.43。王储等人[28]建立了不同品种、年限和生长时期的燕麦干草营养成分含量的模型，其中粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和粗脂肪R${}_{\text{v}\text{a}\text{l}}^2$均在0.83以上，PPD值均大于2.5,略优于本实验的结果，这可能与该研究取样时包含不同生育期样本，以及光谱采集所使用的仪器是波长范围广(1 100～2 492.8 nm)、精度更高的台式近红外仪器有关。对于发酵品质模型而言，所建立的模型中预测效果均比陈鹏飞等[25]建立的苜蓿青贮有机酸预测模型差，可能是陈鹏飞等采集的是冷冻干燥后粉碎样的近红外光谱，在保证了样品均一性的同时，避免了烘干对青贮中有机酸的影响。从样品发酵指标含量来看，本实验中大部分样品中乙酸和丁酸含量都在1%以下，对于有机酸来说，样本的代表性还需要增强。因此，为建立精准度高的模型，样本的收集与代表性样品的选择十分重要，应尽可能的增加样品的产地、品种、生育期等因子的变异范围。在现有仪器限定的基础上采集光谱的过程中，应保证测量时样品状态、装样条件及实验环境的一致性，降低对测量结果的影响。

4 结论

本研究建立了燕麦饲草青贮营养品质的近红外光谱快速检测模型，结果发现干燥样品比新鲜样品的近红外快速检测模型具有更高的预测精度；青贮发酵品质的预测精度未达到实时检测要求，需要进一步研究升级模型，提高其实际应用能力。本研究为便携式近红外光谱仪现场快速检测燕麦青贮品质提供了理论支撑。